一、基因工程中常用的酶及其功能分析（论文文献综述）
李静[1]（2021）在《大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析》文中指出启动子能够决定基因的表达水平,在基因转录调控中占有重要地位。植物启动子的研究一直是分子生物学的研究热点之一,对如何更好的控制外源基因在转基因植物中的表达具有重要意义。大豆在我国被广泛种植,盐碱、干旱等环境因素严重影响了大豆的产量和品质。钙调磷酸酶B样蛋白（calcineurin B-like protein,CBL）是一类钙离子受体,在植物逆境胁迫响应过程中具有重要作用。本课题组前期从大豆中克隆了GmCBL6基因,通过对转GmCBL6基因烟草的抗逆性鉴定结果表明,该基因参与了大豆耐盐和抗旱胁迫反应,对该基因启动子的研究能进一步鉴定该基因的功能。本研究从大豆黑农44基因组中克隆了GmCBL6基因启动子全长及4个不同长度的5’缺失片段,通过烟草的遗传转化,分析GmCBL6基因启动子分子结构及功能。研究结果如下:1.运用PCR克隆得到大豆GmCBL6基因全长启动子,序列长度为1569bp。利用在线软件Plant CARE对启动子序列进行分析,分析结果显示GmCBL6基因启动子中不仅存在TATA-box、CAAT-box核心启动子区域,还存在许多其他顺式作用元件,如干旱相关元件（MBS）、赤霉素响应元件（TATC-box和GARE-motif）、脱落酸响应元件（ABRE）、水杨酸诱导相关元件（TCA-element）、厌氧诱导相关元件（ARE）以及光调控有关元件（AMP-element和G-box）等。2.构建了GmCBL6基因全长启动子驱动的植物表达载体p BI121-PGmCBL6-0,并通过农杆菌介导法将p BI121-PGmCBL6-0转入野生型烟草植株。PCR鉴定结果显示,成功获得4株GmCBL6启动子融合gus报告基因的阳性转化植株。将转基因烟草植株进行高盐（400mmol/L Na Cl）和干旱（300mmol/L甘露醇）胁迫,分别于0、4、8、12、24 h进行GUS组织化学染色和GUS活性检测。GUS组织化学染色结果表明,GmCBL6基因启动子在这两种胁迫下的转基因烟草中能够驱动gus基因的表达,具有启动子活性,在胁迫12 h和24 h时启动子活性最强。GUS活性检测发现,转基因烟草在两种胁迫下4 h时与对照相比活性差别不大,随着胁迫处理时间的延长,GUS活性逐渐提高,在24 h时GUS活性达到峰值。因此,GmCBL6基因启动子是干旱和高盐胁迫诱导型启动子。3.根据GmCBL6基因启动子顺式元件的分布,分别扩增得到PGmCBL6-1（1269bp）、PGmCBL6-2（969bp）、PGmCBL6-3（769bp）和PGmCBL6-4（519bp）四个不同长度的5’缺失片段并构建植物表达载体,瞬时转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,四个缺失片段均具有启动子活性,其中PGmCBL6-2片段活性最强,PGmCBL6-3片段活性最弱。经GUS活性检测发现,4个不同长度区的5’缺失片段的GUS活性有所不同,PGmCBL6-2驱动的gus基因表达活性最高,PGmCBL6-3启动活性最弱。综合以上结果推测在-969-769bp区域是GmCBL6基因启动子的核心功能区,这可能与该区域含有MYB、MRE和TC-rich repeats等响应元件相关。
潘学玮[2]（2020）在《粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子的挖掘及其功能分析》文中指出灵菌红素（Prodigiosin,PG）,一种具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构类物质,是一种微生物次级代谢产生的重要天然红色素。研究发现,灵菌红素具有抗细菌、抗肿瘤和免疫抑制等重要活性,在医药开发、环境治理和染料制备等领域具有巨大的应用价值。因此,近年来粘质沙雷氏菌发酵法生产灵菌红素已成为国内外研究热点。但是,我们对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素背后的调控机制的理解依然有限,这一定程度上制约了微生物发酵法生产灵菌红素产业的发展速度。本论文在实验室前期工作基础上,以产灵菌红素粘质沙雷氏菌JNB5-1为研究对象,通过构建Tn5G转座子插入突变文库,挖掘得到了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子BVG90＿02415（Dac A）、BVG90＿22495（Met R）、BVG90＿13250（Rcs B）、BVG90＿12635（Psr A）和BVG90＿04085（Psr B）,解析了调控因子调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制以及调控因子在影响粘质沙雷氏菌其他细胞进程方面的重要作用。在此基础上,利用代谢工程改造策略,获得了一株灵菌红素高产菌株SK68ΔMet R-PSMWW4vlc02160-Psr A-Psr B。主要研究内容及结果如下:（1）基于Tn5G转座子插入突变技术挖掘灵菌红素合成新型调控因子。通过以大肠杆菌E.coli/p RK2013 Tn5G为供体菌,粘质沙雷氏菌S.marcescens JNB5-1为受体菌,构建Tn5G转座子插入突变文库筛选得到了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子BVG90＿02415、BVG90＿22495、BVG90＿13250、BVG90＿12635和BVG90＿04085等。在确定D-Ala-D-Ala羧肽酶Dac A（BVG90＿02415）负调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素基础上,本论文发现Dac A影响粘质沙雷氏菌灵菌红素合成相关基因pig A基因的表达水平、细胞形态和细胞膜通透性,表明Dac A影响粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制可能为:基因dac A的缺失,增加了菌株细胞膜的通透性及胞内灵菌红素的外渗能力,进而缓解了灵菌红素对pig基因簇的抑制作用,提高了灵菌红素合成基因簇的表达水平,最终增强了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的能力。（2）转录调控因子Met R参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及其功能分析。对Tn5G转座子插入突变技术筛选得到的粘质沙雷氏菌合成灵菌红素调控因子BVG90＿22495进行序列分析及功能验证证实,BVG90＿22495为转录调控因子Met R,为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型负调控因子。较野生型菌株JNB5-1相比,基因met R的缺失,菌株于LB培养基中合成灵菌红素能力提高了91.99%。组合RT-q PCR、融合报告基因的构建、比较转录组学分析和EMSA等实验证实,Met R调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的主要分子机制为:Met R通过负调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素正调控因子Pig P的表达水平,负调控pig基因簇的转录水平,最终影响粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。对Met R调控粘质沙雷氏菌细胞进程进行研究发现,Met R作为一种多功能转录调控因子,除负调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素外,还参与正调控粘质沙雷氏菌L-蛋氨酸生物合成、对H2O2和温度的耐受性、细胞能动性、胞外多糖合成和生物被膜的形成。（3）转录调控因子Rcs B参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及其功能分析。对Tn5G转座子插入突变技术筛选得到的灵菌红素合成调控因子BVG90＿13250进行序列分析及功能验证证实,BVG90＿13250为转录调控因子Rcs B,参与负调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。实验证实,较野生型菌株JNB5-1相比,rcs B基因缺失突变株SK68于LB培养基中发酵产灵菌红素能力提高了128.35%。组合RT-q PCR、融合报告基因的构建、比较转录组学分析和EMSA等实验对Rcs B调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制进行解析发现,Rcs B调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制为:Rcs B通过结合至灵菌红素合成正调控因子Flh DC编码基因flh DC启动子区域的保守位点（5’-TAAGATTATTCCTA-3’）,负调控Flh DC的表达水平,进而负调控pig基因簇的表达水平,最终负调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。对Rcs B调控粘质沙雷氏菌的细胞进程进行研究发现,Rcs B参与调控粘质沙雷氏菌细胞能动性、胞外多糖的合成、生物被膜的形成以及耐酸能力。（4）转录调控因子Psr A和Psr B参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及Psr A功能分析。对Tn5G转座子插入突变技术筛选得到的粘质沙雷氏菌合成灵菌红素调控因子Lys R家族转录调控因子BVG90＿12635和Deo R家族转录调控因子BVG90＿04085进行功能验证证实,转录调控因子BVG90＿12635（本研究命名为Psr A）和BVG90＿04085（本研究命名为Psr B）正调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。Psr A和Psr B的缺失,菌株合成灵菌红素能力分别仅为野生型菌株的0.05倍和0.22倍。对Psr A和Psr B调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制进行解析发现,Psr A和Psr B均通过直接作用于灵菌红素合成基因簇pig基因簇的启动子区域,正调控pig基因簇的表达水平,进而调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。组合比较转录组学分析和生理实验,对转录调控因子Psr A影响粘质沙雷氏菌细胞进程进行研究发现,Psr A作为一种多功能转录调控因子,除参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素外,还参与调控粘质沙雷氏菌细胞能动性、胞外多糖的合成、生物被膜的形成、表面活性剂类物质serrawettin W1的生物合成和T6SS介导的杀菌能力。（5）代谢工程改造粘质沙雷氏菌高产灵菌红素。基于本研究新发现的粘质沙雷氏菌合成灵菌红素相关基因,本论文首先通过整合多基因突变,获得了粘质沙雷氏菌高产灵菌红素突变株SK68ΔMet R-Psr A-Psr B,即以粘质沙雷氏菌rcs B突变株SK68为出发菌株,在敲除灵菌红素合成负调控因子Met R编码基因met R的同时,过表达正调控因子Psr A和Psr B编码基因psr A和psr B。然后,在菌株SK68ΔMet R-Psr A-Psr B的基础上,利用金属蛋白酶编码基因SMWW4＿vlc02160的启动子PSMWW4vlc02160替换基因psr A和psr B的启动子Ppsr A和Ppsr B,得到菌株SK68ΔMet R-PSMWW4vlc02160-Psr A-Psr B。摇瓶发酵分析结果表明,菌株JNB5-1、SK68ΔMet R-Psr A-Psr B和SK68ΔMet R-PSMWW4vlc02160-Psr A-Psr B于发酵培养基中发酵72 h,灵菌红素产量分别为5.33 g/L、7.45 g/L和8.92g/L,生产强度分别为0.074 g·L-1·h-1、0.103 g·L-1·h-1和0.124 g·L-1·h-1。
董实伟[3]（2020）在《毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析》文中认为固有无序蛋白质（Intrinsically disordered proteins,IDPs）是一类在天然状态下整体或局部不折叠,缺乏稳定三维结构,但能够正常行使生物学功能的蛋白质,它普遍存在于蛋白质组中,参与信号转导、转录调控、胁迫应答等一系列生物学过程。目前,有关木本植物IDPs在盐胁迫应答反应中的功能研究鲜有报道。本研究从毛果杨（Populus trichocarpa）中克隆PtrIDP1（Potri.010G161200.1）基因,研究了其蛋白质序列、基因的表达与功能。（1）毛果杨PtrIDP1基因完整的CDs区序列长度为423 bp,共编码140个氨基酸。该蛋白质的理论等电点（pI）为5.58,脂溶指数为58.71,总平均亲水系数为-0.716,不稳定系数为29.60,说明该蛋白为稳定的酸性亲水蛋白。系统进化树分析表明毛果杨PtrIDP1蛋白与胡杨PeIDP1亲缘关系较近。（2）利用实时定量RT-PCR技术分析了 PtrIDP1基因在毛果杨不同组织中的表达特异性和对非生物胁迫的响应表达特性,结果表明:PtrIDP1基因在毛果杨的根、茎、叶中均有表达,其中在根部表达量最低,在茎和叶中相对表达量较高;对PtrIDP1基因在干旱和盐胁迫下的表达进行分析,表明盐胁迫促进PtrIDP1的表达,PEG也能够调节PtrIDP1的表达。（3）构建亚细胞定位表达载体,瞬时转化洋葱表皮细胞,观察显示,PtrIDP1基因编码的蛋白质定位在细胞核内。（4）克隆并构建pROKⅡ-PtrIDP1植物过表达载体,采用农杆菌介导法将PtrIDP1基因转化到毛果杨中,分析PtrIDP1基因在盐胁迫应答反应中的功能。在盐胁迫下,转基因植株的株高明显高于非转基因植株;与非转基因相比,转基因植株叶绿素、SOD、POD含量均显着升高,而MDA含量下降,以上生理指标表明,PtrIDP1基因在杨树中的过量表达显着提高了转基因植株的耐盐性。综上所述,PtrIDP1基因在毛果杨盐胁迫应答反应中发挥重要的作用。
刘会云[4]（2020）在《小麦基因编辑体系优化和几个内源基因的编辑及突变体创制》文中研究表明随着基因编辑技术的发展,规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences,CRISPR）结合Cas9蛋白系统已经在拟南芥、水稻和玉米等二倍体作物中得到了广泛应用。由于小麦是异源六倍体作物,基因组结构比较复杂,农杆菌介导CRISPR/SpCas9系统对小麦内源基因进行编辑的效率一直不高,特别是最新研发的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系统,在小麦中还未见相关报道,本研究拟利用之前研究中获得的无筛选标记材料H29,建立高效的小麦基因编辑系统,进而对小麦内源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG进行编辑,并对突变体进行表型鉴定和功能分析。主要研究结果如下:1.利用OsU6a、TaU3和TaU6启动子构建调控sgRNA表达的CRISPR/SpCas9载体,农杆菌介导对无筛选标记材料H29中的外源GUS基因进行编辑,发现TaU3调控sgRNA时的编辑效率最高（61.4%）。然后利用TaU3作为sgRNA的启动子,构建包含2个串联靶向外源GUS基因靶序列的编辑载体,发现GUS基因的编辑效率可达70.1%,2个靶点间的DNA片段删除效率为37.2%。进一步利用TaU3启动子和双靶点策略,构建靶向外源GUS基因的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9编辑载体,发现CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系统对外源GUS基因的编辑效率分别为3.1%和1.5%。2.构建2个串联靶点gM179和gM471,利用优化的CRISPR/SpCas9系统对小麦品种Fielder和宁春4号中单倍体诱导基因TaMTL进行编辑,编辑效率分别为57.5%和55.2%。在以宁春4号为受体的编辑植株中,发现TaMTL4A和TaMTL4B基因在2个靶点间的DNA片段删除效率分别为10.4%和8.9%;在以Fielder为受体的编辑植株中,发现TaMTL4A、TaMTL4B和TaMTL4D基因在2个靶点间的DNA片段删除效率分别为8.9%、5.9%和7.9%,并发现TaMTL4A和TaMTL4D基因在2个靶点间还出现了DNA片段删除后又反向插入的编辑类型。通过对TaMTL基因编辑植株进行表型、分子和细胞学鉴定,发现编辑植株的繁茂性和结实率等性状显着降低,单倍体诱导率平均为18.9%,同时,还发现了无胚型及胚和胚乳双无型变异的小麦籽粒。3.利用优化的CRISPR/SpCas9系统,对小麦品种Fielder和济麦22中位于5A和5D染色体上的TaAQ和TaDq基因进行编辑,发现Fielder和济麦22中TaQ基因的编辑效率分别为45.6%和44.0%;T0代突变体植株中TaQ基因发生突变使穗部形态发生了很大程度的改变,部分编辑植株不同分蘖表现出不同的穗型。进一步对T1代中TaAQ基因、TaDq基因单独发生编辑和同时发生编辑的突变体进行分析,发现TaDq基因编辑植株与对照相比除了株高降低外,其它性状无明显改变;TaAQ基因编辑和TaAQ、TaDq基因同时编辑的植株与对照相比差异较大,不仅穗部形态类似于拟斯贝尔脱小麦,而且还出现穗变长、小穗数减少、每小穗籽粒数减少和结实率降低等表型。4.利用优化的CRISPR/SpCas9系统和串联双靶点策略,对小麦品种宁春4号、Fielder、济麦22和中麦895中控制籽粒直链淀粉酶合成的TaWaxy基因进行编辑,4个品种的编辑效率分别为80.5%、71.6%、74.7%和66.7%。在编辑植株中,TaWaxy4A、TaWaxy7A和TaWaxy7D基因在2个靶点间检测到DNA片段删除的类型,并且还在TaWaxy4A和TaWaxy7A基因的2个靶点间检测到DNA片段删除后又反向插入的突变类型;利用I2-KI对TaWaxy基因发生编辑植株的籽粒进行染色,发现突变体籽粒的胚乳中基本不含直链淀粉;透射电镜结果显示,突变体籽粒的A型淀粉颗粒在形状和大小上都发生了改变。5.构建TaU6作为sgRNA启动子的表达载体,利用CRISPR/SpCas9系统对小麦品种Fielder中第二同源群上的TaARG基因进行编辑。检测结果表明,3个等位基因TaARG2A、TaARG2B和TaARG2D的编辑效率均不到10.0%。进一步对TaARG基因发生编辑的纯合突变植株进行分析,虽然突变植株的表型性状与对照相比无明显的差异,但是在转录水平上TaOAT、TaP5CDH和TaOTC基因在突变体的穗梗和种子中的表达量却显着降低,另外,在突变体的籽粒中,尸胺的含量与对照相比呈现一定的下降趋势,而亚精胺和精胺的含量与对照相比却呈现上升的趋势,并且在突变体的茎秆中除了赖氨酸外其余氨基酸和粗蛋白的含量都呈下降的趋势。
邓晶[5]（2020）在《大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析》文中提出植物基因工程在增强植物抗逆性、提高作物产量以及改良品质等方面发挥重要的作用,常常需要外源基因在受体植物中进行异源表达。而启动子可与转录因子结合并协调作用调控下游基因的表达模式及程度。并且,对启动子的深入研究还可以加强人们对植物生长发育各个阶段中植物内部调控过程的分子机制的了解,因此启动子已在植物基因工程中得到广泛地应用。有研究预测RIQ基因N末端的转运肽能够特异靶向叶绿体,并且存在高度保守且功能未知的结构域1118,该基因编码的蛋白能够特异定位于类囊体膜上,通过调节基粒堆叠的程度以优化捕光复合物II结构,最终对植物起到光保护的作用。本课题组前期从大豆基因组中分离得到Gm RIQ2基因,研究发现该基因CDS序列全长为585 bp,编码194个氨基酸,具备跨膜结构,属于膜蛋白,其蛋白定位于叶绿体。而且在植物光保护及抗旱调节中发挥作用,并推测可能参与种子产量的负调控过程。如通过对基因的启动子进行分析,可以更全面深入地研究基因功能。因此本研究以大豆垦丰16为材料,提取基因组DNA并运用PCR技术分离得到Gm RIQ2基因的启动子序列;构建植物表达载体并转化大豆及拟南芥;运用5’端缺失法获得三个不同长度的Gm RIQ2基因启动子缺失片段,分别构建缺失片段表达载体并转化拟南芥;通过生物信息学、组织化学染色、GUS酶活性检测及荧光定量PCR的一系列分析,对Gm RIQ2基因启动子的结构及功能进行初步分析,旨在明确该启动子的调控基础及其调控基因表达时其内部功能元件的调节作用,为研究Gm RIQ2基因的功能和作用机理奠定良好的科学基础。研究结果如下:1、通过PCR扩增获得长度为1661 bp的大豆Gm RIQ2基因启动子,命名为PGm RIQ2,通过Plant CARE在线分析网站发现该启动子序列中不仅含大量基础调控元件:TATA-box和CAAT-box,还存在生长素响应基序Aux RR-core,参与茉莉酸甲酯反应的响应基序TGACG-motif和CGTCA-motif,与脱落酸诱导有关的调控元件ABRE,种子特异性表达元件RY-element,厌氧感应调节元件ARE以及若干参与光反应的调控基序:ATCT-motif、BoxⅡ、G-box、GATA-motif和TCT-motif。2、构建Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体,利用发根农杆菌介导转化大豆子叶节,GUS染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动GUS基因在大豆根系中表达,表明该启动子具有启动活性,并且其发根转化率和阳性诱导率与Ca MV35S启动子无明显差异。3、Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体转化拟南芥,GUS组织化学染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动报告基因在转基因拟南芥全株表达,且在莲座叶维管组织中存在高效表达的优势,生育初期具有明显的时空表达特性。4、根据生物信息学分析结果,结合序列上顺式作用元件分布及元件功能预测,通过5’端缺失法,扩增获得三个长度分别为450 bp、284 bp和194 bp的Gm RIQ2基因启动子缺失片段。构建三个含Gm RIQ2基因启动子缺失片段的植物表达载体,采用花序浸泡法分别转化拟南芥,GUS染色表明Gm RIQ2基因启动子缺失片段均能驱动报告基因在拟南芥中表达,其表达水平与缺失片段长度正相关,但在莲座叶维管组织中仍具有表达优势。5、将获得的转基因拟南芥分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,用300μmolm-2·s-1光照强度处理,经GUS酶活性检测发现Gm RIQ2基因全长启动子可以应答生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯及光信号的诱导,并初步确定生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的应答元件分别位于-1661～-450 bp、-450～-284 bp和-284～-194 bp,初步推断该启动子具有诱导型启动子特性。6、将大豆KF16分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,经q RT-PCR检测,结果表明Gm RIQ2基因受生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的负调控。
张玉[6]（2020）在《S1DNMT2基因RNAi表达载体构建及其功能分析》文中提出植物在生长发育过程中可能受到一定的生物胁迫与非生物胁迫。植物响应非生物胁迫时发生一系列生理生化反应,以适应不同的环境变化。DNMTs是植株DNA甲基化过程中重要的甲基转移酶。目前关于植物体内DNA甲基过程中DNMT2的作用机制和功能性分析实验研究较少,因此,研究DNMT2基因在植物生长发育过程中或植物抗逆性过程中的功能和作用,对提高作物抗性和品质具有重要意义。本文以模式植物番茄（Solanum lycopersicum）为实验材料,通过NCBI数据库比对获得11种物种中DNMT2蛋白的氨基酸序列,然后通过DNMAN软件进行蛋白质保守域的分析,发现这些氨基酸序列具有相对比较保守的蛋白结构域。对这11种蛋白质氨基酸序列进行进化树分析和DNA甲基化结构域分析,结果表明番茄SlDNMT2蛋白与马铃薯St DNMT2蛋白的亲缘关系较近,同源性高达95.54%。同时构建SlDNMT2的多个植物表达载体进行一系列生理生化分析。首先,构建表达绿色荧光蛋白的融合表达载体p ART27-SlDNMT2-e GFP观察SlDNMT2蛋白的亚细胞定位情况,结果表明SlDNMT2蛋白定位于细胞核中。利用植物基因工程技术和RNAi干扰技术,构建RNAi转基因表达载体p BI121-SlDNMT2-si RNA,并通过农杆菌介导的侵染法,侵染番茄野生型（AC）受体,进而通过植物组织培养技术与分子生物学技术,最终成功得到转基因阳性植株,并利用Real-time PCR技术确定RNAi转基因植株中SlDNMT2基因已被下调。高盐、重金属污染以及干旱是影响植物生长发育的重要环境因素,为此我们分析了高盐、重金属以及干旱条件下转基因植株的生长发育状态。首先,我们分析了200 mmol/L Na Cl和300 mmol/L甘露醇胁迫处理条件下,野生型与转基因番茄植株的生长状态,结果发现在200 mmol/L盐胁迫和300 mmol/L甘露醇处理条件下,野生型番茄（AC）的生长发育的状态都比转基因植株更好,且鲜重具有显着性差异,这说明SlDNMT2 RNAi转基因植株对盐胁迫和甘露醇胁迫较敏感。其次,我们还分析了SlDNMT2 RNAi转基因植株在不同二价重金属离子胁迫条件下的生长发育情况,结果发现在Zn2+胁迫条件下,RNAi转基因植株生长状态较差,该结果表明RNAi转基因植株对Zn2+抗性较低。但是,在Fe2+胁迫条件下,RNAi转基因植株的根系较野生型番茄（AC）植株更发达,RNAi转基因植株根的总数目较野生型番茄（AC）更多,该结果表明RNAi转基因植株的根系对Fe2+抗性较高。最后,我们将土培种植的野生型番茄和SlDNMT2 RNAi转基因植株共同干旱处理10 d,结果发现转基因植株的生长状态与野生型相比更差,叶片卷曲程度更为严重,该实验结果进一步验证:与野生型番茄相比,RNAi转基因植株较不耐旱。进一步通过显微镜观察RNAi转基因植物和野生型植物叶片中气孔的数目,结果发现转基因植株叶片中气孔的分布较野生型更密集,这一结果说明:RNAi转基因植物不耐旱的原因可能与叶片中气孔数目的增多有关。据报道,拟南芥中TINY1基因、SAG1基因可能参与响应干旱胁迫,我们利用半定量技术分析了他们在番茄植株中的同源基因Sl TINY1、Sl SAG1的表达情况,结果显示:与野生型相比,Sl SAG1基因在转基因植株中的含量没有明显变化;但是Sl TINY1基因在转基因植株中的含量下调了。通过以上结果和数据分析发现SlDNMT2基因可能参与植物应对胁迫环境的应答途径,但是,具体调节机制有待后续进一步探究。该文为进一步分析SlDNMT2基因在DNA甲基化过程中的功能作用奠定了良好的科学基础,对进一步探究植物体内DNA甲基转移酶DNMT2基因作用的分子机制具有重要意义。为进一步研究遗传育种和改良作物以及植物对逆境胁迫的抗性提供了科学依据和实验基础。
高文杰[7]（2019）在《茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析》文中研究表明神农香菊（Chrysanthemum indicum var.aromaticum）是菊属植物中罕见的具有浓郁香味的种。前期研究发现其叶片、花瓣均被有许多腺毛,而腺毛的胶状分泌物又与植株香气物质产生密切相关,经气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析发现其叶片分泌物主要为单萜和倍半萜及其含氧衍生物。目前,关于神农香菊香味形成的原因及分子调控机理至今未见报道。本研究以茉莉酸甲酯（MeJA）作为一种外源诱导剂,通过对神农香菊进行不同浓度和时间的MeJA处理,优选出MeJA增香的最佳条件,并对MeJA处理下的神农香菊进行转录组测序分析,从分子水平揭示神农香菊萜类物质合成途径的调控机理,挖掘神农香菊萜类物质合成相关基因,分析这些基因在萜类代谢途径上的功能,为进一步采用转基因工程技术创制高萜类芳香材料提供依据,使培育芳香的菊花新材料成为可能。主要研究结果如下:1.随着MeJA处理浓度和处理时间的增加,神农香菊T-形非腺毛和头状腺毛的密度呈先升高后降低的趋势。叶片分泌物中萜烯类的相对含量随着MeJA处理浓度和处理时间的增加而增加,其中,4-亚甲基-1-（1-甲基乙基）双环[3.1.0]2-己烯和石竹烯含量的变化最显着;苯、醇类的相对含量则呈先升高后降低的趋势。在0.5%浓度和48 h处理下,对/间伞花烃、香树烯的含量开始下降,而（-）-,α-人参烯、马榄烯、愈创木烯和cis-桧萜醇则消失。这些结果表明神农香菊叶片表皮毛数量及其分泌物含量能够响应MeJA的诱导,并在浓度为0.25%和处理时间为24h时的诱导效果最显着。2.对MeJA溶液不同诱导时间下的神农香菊叶片进行了转录组测序,共获得176,091个Unigenes,能够至少在一个数据库中被注释的Unigenes占69.94%。在MJ4vsCtrl、MJ24vsCtrl和MJ24vsMJ4比较组中分别获得了 750、650和313个差异表达基因（DEGs）,这些差异基因被富集到33个次生代谢相关途径。对参与茉莉酸（JA）生物合成和信号转导途径、萜类物质合成途径、苯丙烷类代谢途径和脂肪酸类代谢途径的DEGs,以及差异表达的次生代谢相关植物后修饰酶和转录因子进行表达热图分析,发现大多数DEGs受MeJA的诱导上调表达。qRT-PCR试验结果与转录组测序结果基本一致,表明转录组数据测序的基因表达谱数据是可信的。3.参考转录组组装序列分别克隆了长度为1278 bp和1035 bp的神农香菊GPS和FPS基因的开放阅读框（ORF）序列,分别命名为CiGPS和CiFPS。系统进化分析发现,CiGPS和CiFPS基因分别与青蒿和菊花的亲缘关系最近。蛋白质的理化性质分析表明,两个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白。qRT-PCR结果显示,CiGPS和CiFPS基因均在叶中的表达量最高,且MeJA可诱导CiFPS基因的表达。构建植物表达载体pBI121-CiGPS-GFP和pBI121-CiFPS-GFP,农杆菌介导法转入烟草中,经Kana生根筛选及PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性苗,对差异表达的3个转基因株系进行后续的功能分析。转CiGPS和CiFPS基因烟草与野生型（WT）及转空载株系（EV）相比,株高变矮,叶色变深,叶绿素和类胡萝卜素含量升高;叶片长柄腺毛数量显着增加,短柄腺毛仅在转CiGPS株系叶片正面显着增加;叶片分泌物中萜烯类物质相对含量显着升高,并且在转基因株系中检测到WT和EV株系中未检测到的单萜类和倍半萜类化合物;转CiGPS基因烟草中GPS酶活性升高,而转CiFPS基因烟草中FPS酶活性,仅F6株系显着高于WT和EV株系;在转CiGPS基因烟草植株中HMGR、DXR、GGPPS和MTS基因的表达量升高,EAS基因的表达量降低;在转CiFPS基因烟草植株中HMGR、DXS、DXR、GGPPS、EAS和CCD基因的表达量升高,MTS基因的表达量降低。4.利用神农香菊转录组数据库克隆了长度为1881 bp的神农香菊MYC2基因的ORF序列,命名为CiMYC2。通过系统进化分析发现,它与青蒿的AaMYC2基因的亲缘关系最近。蛋白质的理化性质分析表明,CiMYC2蛋白质属于亲水性蛋白。CiMYC2基因表达模式分析显示,它在叶中的表达量最高,且受MeJA的诱导。构建植物表达载体pBI121-CiMYC2-GFP,CiMYC2蛋白亚细胞定位在细胞核上。农杆菌介导法转入烟草中,经Kana生根筛选及PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性苗,选择差异表达的4个转基因株系进行基因的功能分析。CiMYC2基因在烟草中过表达后,株高变矮,叶色变深,叶绿素和类胡萝卜素含量升高;叶片长柄和短柄腺毛数量均显着增加,叶片分泌物中萜烯类物质相对含量显着升高,并且在转基因株系中检测到WT和EV株系中未检测到的萜烯类化合物;在转CiMYC2基因烟草植株中HMGR、DXR、GGPPS、MTS和CCD基因上调表达,EAS基因下调表达,DXS、GPS、FPS和EAS基因仅在个别转基因株系中上调表达。
王义[8]（2019）在《橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究》文中研究指明橡胶树白粉病是橡胶树最具经济破坏性的病害之一,其病原物—橡胶树白粉菌Oidium heveae Steinm是专性寄生真菌,有性世代尚未被发现,特别是其无法离体培养,遗传转化体系未见报道。本研究通过研究橡胶树白粉菌的专性寄生特性及其生理生化特性,对转化介质、分生孢子悬浮液的配制方法、分生孢子的抗生素敏感性、转化子的筛选与观察方法、报告基因的选择及电击缓冲液等多方面进行了研究。利用电击转化法和农杆菌介导法（ATMT）成功构建了橡胶树白粉菌的遗传转化体系,并在橡胶树白粉菌基因组基础上,筛选和鉴定了来自橡胶树白粉菌的50个内源启动子,为进一步优化橡胶树白粉菌遗传转化体系、开展更深入的分子研究,以及探明白粉菌的致病分子机制和生物进化提供科学依据。具体研究结果如下:测试了8种常用抗生素对O.heveae分生孢子的敏感性。结果表明,潮霉素B、卡那霉素和链霉素浓度为100μg/m L,氯霉素浓度为510μg/m L和头孢霉素浓度为1000μg/m L时,可以有效地抑制O.heveae分生孢子的萌发。氨苄青霉素、利福平和四环素对橡胶树白粉菌分生孢子的萌发和生长没有明显的抑制作用,甚至部分还能促进分生孢子的萌发。8种抗生素中仅潮霉素B对橡胶树古铜期嫩叶具有明显的植物毒性。因此,确定卡那霉素、氯霉素、头孢菌素和链霉素抗性的基因适合于用作橡胶树白粉菌遗传转化的选择标记。测定葡萄糖、甘露醇、山梨醇、HEPES、PEG1000不同浓度的水溶液对橡胶树白粉菌分生孢子萌发的影响。结果表明,只有40 m M的HEPES对橡胶树白粉菌分生孢子的影响最小,与对照组水溶液非常接近。因此确定40 m M的HEPES作为橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液。选择卡那霉素抗性基因为筛选标记,引入红色荧光蛋白基因m Cherry为报告基因,成功构建表达载体p CAMBIA1302-m Cherry。在常规电击转化和ATMT法的基础上改进和创新,优化各类参数。转化后通过荧光显微镜观察到分生孢子、芽管、附着胞、初生菌丝、次生菌丝和分生孢子梗都具有红色荧光,而对照组野生型无荧光。转化后的橡胶树白粉菌T1到T10代都扩增到m Cherry基因,证明转化体非常稳定。PCR-Southern印迹杂交分析也证实靶基因整合进了橡胶树白粉菌的基因组中。电击转化体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;电击转化前混合物（载体DNA和O.heveae）的冰浴时间:1 min;电击转化的电压:2.5 kv;电脉冲,4.0 ms;电穿孔后的冰浴时间:5 min。ATMT体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;农杆菌复摇浓度:OD600=0.6～0.8;共培养时间:30 min。该电击转化和ATMT法转化体系的成功建立,对于研究外源基因的功能,相关效应蛋白的功能,橡胶树白粉菌的分子致病机制及其与宿主的互作都是非常有利的,更为其它专性寄生真菌的遗传转化提供了借鉴。以橡胶树白粉菌HO-73基因组数据为基础,利用生物信息学在线软件Promoter Scan进行启动子预测,得到疑似启动子135个。随后利用生物信息学在线预测软件Softberry进行二次筛选,得到50个疑似启动子序列。成功克隆获得50个内源疑似启动子序列并构建了其植物表达载体,利用烟草转基因技术进行瞬时表达验证其启动子功能,验证得到9个内源启动子。通过与阳性对照Ca MV 35S（35S）启动子的比较,初步判断其中4个（WY7、WY51、WY193和WY195）为强启动子,另5个（WY1、WY6、WY12、WY181和WY196）为弱启动子。通过q RT-PCR技术测定4个强启动子（WY7、WY51、WY193和WY195）调控GUS基因的表达量,均明显高于35S。其中WY195调控GUS基因的表达量最高,约为35S的17.54倍;WY7约为35S的11.72倍;WY51约为35S的8.38倍;WY193约为35S的8.34倍。利用橡胶树白粉菌内源强启动子WY7、WY51、WY193和WY195驱动GUS基因在双子叶植物烟草、橡胶和火龙果,以及单子叶植物水稻、玉米和大麦中进行瞬时表达,探索其调控转录范围。结果证明这4个强启动子既可以在单子叶植物中驱动外源基因高效表达,也可以在双子叶植物中驱动外源基因高效表达,具有极大的开发潜力。利用生物信息学在线软件Plant CARE对这4个强启动子的序列进行了顺式作用元件的预测和分析,根据顺式作用元件的类型和作用推测启动子的诱导类型,并通过对该4个启动子转基因烟草T1代实施相应诱导,初步确定了WY7为高温诱导启动子,WY51为低温诱导启动子,WY195是高温干旱盐诱导启动子。WY193的启动子诱导类型尚未确定。利用ATMT法获得了WY195-hpa Xm转基因烟草植株。接种TMV于T1代转基因植株,结果表明,与野生型三生烟和阳性对照35S-hpa Xm转基因烟草相比,WY195-hpa Xm转基因烟草植株的TMV抗性明显提高。WY195-hpa Xm转基因T1代植株与野生型烟草相比平均病斑数减少66.44%,与阳性对照相比平均病斑数减少52.48%。通过在线数据库PROMO和JASPAR数据库进行转录因子及其结合位点的预测和分析,以此为依据确定突变位点,利用渐变缺失突变对WY195的全长序列研究,瞬时表达量的测定结果初步鉴定了WY195的全长序列,这为后续工作中对启动子精确调控能力、进行有效改造及相关转录因子的研究奠定了基础。内源启动子的成功预测、筛选和鉴定,有利于理解橡胶树白粉菌的转录机制,也为构建其遗传转化体系提供了参考,更为植物转基因工程提供了新的工具和选择。
陈宁[9]（2018）在《诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用》文中认为利用基因工程方法培育雄性不育系,尤其是雄性不育-保持兼用系,是更好地利用作物的杂交优势的新途径之一。当今利用该方法构建的兼用系,多数为雄性常态可育,通过改变外界环境或外源喷施诱导剂转变为不育。这些体系的主要缺点是调节雄性育性的时间窗口较窄,而且有时需要多次调节。为了补足这一短板,本研究在对前期克隆到的花丝特异性启动子AtDAD1进行解析的基础上,构建了以它为基础的新型诱导性雄性不育体系——诱导恢复性智能雄性不育体系,并且在拟南芥上得到验证。主要结果如下:用DADB（AtDAD1启动子的转化用全长片段）驱动GUS基因转化拟南芥,GUS基因在拟南芥中有极强的花丝特异性表达,在其他花器官和营养器官中则表达不明显。这种表达从花期12开始,一直保持直至授粉完成。对DADB进行了 5’和3’端的删除,发现决定花丝特异性的关键元件位于-1938 bp～-2947 bp 区段。以DADB驱动本实验室改良的Barnase基因——mBarnV作为“雄性不育”基因（DADB::mBarnV）导入拟南芥后,转基因植株的花丝变短,花药居于柱头下方,花粉量显着减少并且残存的花粉败育,从而导致雄性彻底不育,但雌蕊的育性不受影响。将此雄性不育基因与“恢复基因”PR2as::Barstar相偶联,导入拟南芥后,转基因植株T1代在自然状态下为雄性不育（表型同单转DADB::mBarnV的植株）,但在外源施用水杨酸（SA）诱导后雄性育性得以恢复,从而能够自花授粉受精产生正常的角果和种子。这一性状能够稳定地传递到后代。外源喷施SA的时间窗口从花期10到花期12,长达2周,而且每三天喷施一次即可。与之平行,用花药绒毡层特异性启动子TA29驱动mBarnV基因,再串联改良的PR-1a启动子（8AnBx）驱动的Barstar基因,构成第2个诱导恢复性雄性不育表达载体。导入拟南芥后,转基因植株Ti代在自然条件下呈现出花药发育不良、不能产生正常的角果和种子的表型,但在绒毡层发育时期喷施SA后,花药的发育恢复正常,能够自花授粉受精产生正常的角果与种子。比较上述两种体系,前者（以DADB为基础）留给外源施用诱导剂的时间窗口比后者（以TA29为基础）更宽,因此也能够更方便、更经济地外源施用诱导剂。通过农杆菌介导转化法将以DADB为基础的诱导恢复性智能雄性不育系统移植到甘蓝型油菜（品种:West-4）中,获得少量转基因油菜植株。转基因油菜T1代植株在自然条件下,呈现出只有部分花朵的花丝变短、花粉数量减少且有部分败育,但是整株仍然能产生正常的角果和种子。这种雄性不育性不完全的原因还有待进一步的研究。本研究的结果不仅提供了两个诱导恢复性智能雄性不育体系,而且为构建其它新的诱导恢复育性雄性不育体系提供了新的思路和实践的参考。
周杰[10]（2017）在《粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析》文中研究表明粘细菌（Myxobacteria）是一类具有复杂多细胞社会性行为的革兰氏阴性菌,是研究生物发育的最简单的模式生物,也是一种重要的药源微生物类群。该类微生物的基因组复杂性高,基因组最大可达14.78 Mb,基因组信息分析显示水解酶类基因占到其基因组的～2.7%。糖苷水解酶在淀粉工业、食品加工及农业生产等多个行业都具有重要的应用价值。因此,挖掘粘细菌中的新糖苷水解酶对于扩展对该家族酶的认识及为工农业生产提供新的酶资源方面具有重要的意义。Corallococcus sp.EGB是本实验室分离保存的一株具有良好抗真菌能力的粘细菌,其发酵的胞外上清液具有丰富的糖苷水解酶活性。本研究以EGB菌株为材料,挖掘其基因组中具有应用研究价值的糖苷水解酶,并在分子水平、酶学性质及催化机理等方面对其进行了详细的研究。利用基因组生物信息学分析、蛋白纯化、功能验证等手段从EGB菌株中鉴定了多个葡聚糖水解酶及其基因。其中有一个新型的淀粉酶基因coMA,该基因全长1665 bp,G+C%高达69.19%,编码554个氨基酸,分子量为59.95 kDa。CoMA的N端前26个氨基酸为典型的信号肽序列。BlastP序列比对、进化树分析结果显示淀粉酶CoMA可归类于糖苷水解酶GH13家族中一个新的亚家族GH1343。本文构建了coMA的全长表达菌株E.coli BL21（DE3）-（pET29a（+）-coMA）,实现了 重组酶 CoMA 在E.coli BL21（DE3）中可溶性表达。经镍柱亲和层析纯化,在以可溶性淀粉为底物时比酶活力高达980 U/mg。CoMA对直链淀粉、支链淀粉、糖原、γ-环糊精、麦芽寡糖（≥G3）以及普鲁兰多糖均具有不同程度的水解作用。水解产物分析结果显示,以淀粉或麦芽三糖为底物时,水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖;以γ-环糊精为底物时,同样产生高纯度的麦芽糖;CoMA还能作用于普鲁兰多糖,产生唯一的水解产物—潘糖（panose）。以上酶学性质表明,该酶表现出高效的水解效率及独特的催化机制,使得淀粉水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖,这与已报道淀粉酶的理化性质完全不同。为了进一步阐明CoMA独特的水解特性,首先对CoMA水解淀粉过程的蓝值和旋光度进行测量,结果表明CoMA属于内切型的α-淀粉酶,有别于β-淀粉酶、外切型的产麦芽糖α-淀粉酶。随后,对CoMA水解可溶性淀粉和麦芽三糖（20 mM G3）过程中的产物进行HPLC监测。结果表明,CoMA不仅具有水解α-1,4-键的活性,还具有转糖基活性（transglycosylation activity）以及缩合活性（condensation activity）,我们推测这种多分子催化的协同作用是CoMA产高纯度麦芽糖的原因。为进一步阐明其多分子催化机制,对CoMA水解低浓度（2 mM）和高浓度（200 mM）麦芽三糖过程中的产物同样进行了监测。当CoMA水解低浓度的麦芽三糖时,整个水解过程只产生麦芽糖。表明在CoMA的转糖基活性中,转葡萄糖基活性（glucosyl-transfer activity）要高于转麦芽糖基活性（maltosyl-transfer activity）,即CoMA偏好从麦芽三糖的非还原端进行切割,同时释放麦芽糖单元并将剩下的葡萄糖单元转移给一个新的麦芽三糖形成麦芽四糖,麦芽四糖进一步被水解成2分子的麦芽糖（2G3→G2+G4→3G2）,因此整个催化过程只产生麦芽糖且无葡萄糖和其他麦芽寡糖的形成。随后的定点突变及EDC化学修饰实验表明其多分子催化活性都源于同一催化活性中心（D243-E286-D359）。基于麦芽糖淀粉酶CoMA具有利用麦芽寡糖和淀粉生产高纯度麦芽糖的特性,因此CoMA具有被应用于工业上制备高纯度麦芽糖的潜力,起着去除其他麦芽寡糖提高麦芽糖含量的作用。然而,由于CoMA在大肠杆菌中表达量较低,仅有3.3 mg/升发酵液。本文尝试了利用真核表达系统对其进行异源表达,构建表达菌株Pichia pastoris GS115（pEαA-coMA）,经甲醇诱导发酵后,表达量提高到54 mg/升培养液。重组酶性质稳定,在以淀粉为底物时,依然产生高纯度的麦芽糖。在联合本实验室一个具有良好液化能力的a-淀粉酶AmyM处理10%的淀粉时,麦芽糖的得率提高了 5倍。进而,通过基因工程手段将AmyM和CoMA这两个蛋白通过不同的连接肽进行连接,构建了三组融合蛋白。其中使用柔性连接肽（flexible linker）连接的融合蛋白（M-S2-Z）性质最优,其在酵母分泌表达量最高,达到140 mg/升发酵液。且在处理淀粉制备麦芽糖中,其麦芽糖得率最高为6%。通过基因组分析,从EGB菌株中还克隆到一个新型的β-1,3-葡聚糖酶基因lamC。该基因全长1317 bp,G+C%高达为69.8%,编码438个氨基酸,分子量为47 kDa。该酶含有一个fascin-like结构域和一个GH16催化结构域。Fascin-like结构域具有典型的β-trefoil三维结构,该结构域常出现于动物细胞的Actin结合蛋白中。Fascin-like结构域在细菌的糖苷水解酶中属于首次发现,fascin-like结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知。构建了表达菌株E.coli Origami B（DE3）-（pET32a（+）-lamC）,在Trx标签的作用下实现了重组酶rLamC在E.coli Origami B（DE3）中的可溶性表达。rLamC具有特殊的广底物谱活性,对β-（1,3）-葡聚糖型底物（昆布多糖、茯苓多糖、酵母葡聚糖和可得然胶）、β-（1,4）-葡聚糖型底物（羧甲基纤维素钠）、β-（1,4）-木聚糖型底物（木聚糖）和β-（1,6）-葡聚糖型底物（石耳素）都具有不同程度的水解活性。同时,rLamC对β-（1,3）/（1,6）-葡聚糖表现出外切酶活性,对β-（1,4）-木聚糖/葡聚糖则表现为内切酶活性。活性中心的定点突变（E304A和E309A）实验发现,LamC的广底物谱活性都源于同一催化活性中心。本文也首次研究了 LamC的fascin-like结构域的潜在功能。采用截短表达、酶表观动力学以及酶-多糖底物pull-down实验,证明了 LamC的fascin-like结构域是一种具有结合β-（1,3）-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合结构域;然而fascin-like结构域不具有结合F-actin的能力。同时构建了 LamC的酵母表达菌株P.pastoris GS115（pEFαA-lamC）,经96 h发酵诱导后表达量达到160 mg/L。通过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析将LamC从发酵液中纯化2.8倍,回收率达到48%。LamC的最适底物为昆布多糖,其相应的Km和Vmax值分别为1.4 mg/mL和12.6 μmol.min-1.mg-1。最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.0。Mn2+、DTT对LamC酶活有促进作用,Cu2+、Co2+、EDTA对酶活具有强烈的抑制作用。同时,LamC还具有水解稻瘟病菌孢子及菌丝细胞壁的能力。综上所述,从粘细菌Corallococcus sp.EGB中鉴定了两个新型的葡聚糖水解酶及其基因。其中一个为麦芽糖淀粉酶CoMA,该酶具有水解淀粉和麦芽寡糖产生高纯度的麦芽糖且产物中不含葡萄糖的显着特点;另一个是具有广底物谱活性的β-1,3-葡聚糖酶LamC,并首次证明了 LamC的fascin-like结构域是一个具有结合β-1,3-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合域（CBM）。
二、基因工程中常用的酶及其功能分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因工程中常用的酶及其功能分析（论文提纲范文）
（1）大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 启动子的结构和功能 |
| 1.2.1 核心启动子区 |
| 1.2.2 上游启动子区 |
| 1.3 启动子的类型 |
| 1.3.1 组成型启动子 |
| 1.3.2 组织特异型启动子 |
| 1.3.3 诱导型启动子 |
| 1.4 植物CBL基因家族的研究进展 |
| 1.4.1 CBL的结构 |
| 1.4.2 CBL-CIPK的作用机制 |
| 1.4.3 CBL-CIPK信号系统提高植物抗逆性 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL6 基因全长启动子克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌种与载体 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大豆GmCBL6 基因全长启动子的克隆 |
| 2.3.2 GmCBL6 基因全长启动子的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 GmCBL6 基因全长启动子的克隆 |
| 2.4.2 GmCBL6 基因全长启动子的生物信息学分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 GmCBL6 基因全长启动子的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌种与载体 |
| 3.2.3 主要药品与仪器设备 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 GmCBL6 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 3.3.3 GmCBL6 全长启动子对烟草的遗传转化 |
| 3.3.4 非生物胁迫下转基因烟草的GUS检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GmCBL6 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 3.4.2 重组植物表达载体p BI121-PGmCBL6-0 转化农杆菌的鉴定 |
| 3.4.3 转基因植株的PCR鉴定 |
| 3.4.4 GUS组织化学染色法验证启动子活性 |
| 3.4.5 GUS活性测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 GmCBL6 基因启动子5’端缺失片段的克隆与功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌种与载体 |
| 4.2.3 主要药品与仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 引物设计 |
| 4.3.2 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 4.3.3 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段植物表达载体的构建 |
| 4.3.4 重组植物表达载体转化农杆菌 |
| 4.3.5 启动子5’缺失片段瞬时转化烟草 |
| 4.3.6 GUS组织化学染色 |
| 4.3.7 GUS活性测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 4.4.2 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段植物表达载体的构建 |
| 4.4.3 启动子5’缺失片段重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.4.4 组织化学染色法鉴定启动子缺失体活性 |
| 4.4.5 GmCBL6 基因启动子5’缺失体驱动的GUS活性变化 |
| 4.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子的挖掘及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 灵菌红素概述 |
| 1.1.1 灵菌红素的结构及理化性质 |
| 1.1.2 灵菌红素的生理功能 |
| 1.1.3 灵菌红素的生产方法 |
| 1.2 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的生物合成途径及转录调控 |
| 1.2.1 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的生物合成途径 |
| 1.2.2 转录调控因子对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响 |
| 1.2.3 其他调控因子对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响 |
| 1.3 灵菌红素生产菌株育种进展及代谢工程研究 |
| 1.3.1 发酵条件的优化对粘质沙雷氏菌等菌株合成灵菌红素的影响 |
| 1.3.2 诱变育种及代谢工程改造选育高产灵菌红素菌株研究进展 |
| 1.4 转录调控因子参与调控细菌细胞进程研究进展 |
| 1.4.1 转录调控因子RcsB参与调控细菌细胞进程研究进展 |
| 1.4.2 转录调控因子MetR参与调控细菌细胞进程研究进展 |
| 1.4.3 其他转录调控因子参与调控细胞进程研究进展 |
| 1.5 研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 基于Tn5G转座子插入突变技术挖掘粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 培养基与培养条件 |
| 2.2.5 转座子插入突变文库的构建以及灵菌红素合成突变株的筛选 |
| 2.2.6 粘质沙雷氏菌灵菌红素合成突变株中Tn5G转座子插入位点的鉴定及突变株SK4-72的功能互补 |
| 2.2.7 粘质沙雷氏菌dacB、dacC和 dacD基因缺失突变株的构建 |
| 2.2.8 生长曲线的测定 |
| 2.2.9 RNA的提取和RT-q PCR |
| 2.2.10 菌株JNB5-1、SK4-72和SK4-72/p XW1803 的形态观察 |
| 2.2.11 菌株JNB5-1、SK4-72和SK4-72/p XW1803 细胞内膜和细胞外膜通透性的测定 |
| 2.2.12 菌株JNB5-1、SK4-72、SK4-72/p XW1803、JNB5-1ΔDacB、JNB5-1ΔDacC和JNB5-1ΔDacD发酵产灵菌红素的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素相关基因的筛选 |
| 2.3.2 D-Ala-D-Ala羧肽酶DacA参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的功能验证 |
| 2.3.3 D-Ala-D-Ala羧肽酶DacB、DacC和 DacD不参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素 |
| 2.3.4 DacA参与调控粘质沙雷氏菌灵菌红素合成基因簇pig基因簇的表达水平 |
| 2.3.5 DacA为粘质沙雷氏菌维持正常细胞形态所必须 |
| 2.3.6 DacA参与调控粘质沙雷氏菌细胞膜的通透性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 转录调控因子MetR参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 引物 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 培养基与培养条件 |
| 3.2.5 转座子插入突变文库的构建以及突变株ZK66的筛选 |
| 3.2.6 突变株ZK66中Tn5G转座子插入位点的鉴定 |
| 3.2.7 粘质沙雷氏菌基因缺失突变株的构建及过表达菌株的构建 |
| 3.2.8 生长曲线的测定 |
| 3.2.9 RNA的提取和RT-qPCR |
| 3.2.10 转录融合报告基因的构建 |
| 3.2.11 β-半乳糖苷酶酶活的测定 |
| 3.2.12 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 3.2.13 比较转录组学分析 |
| 3.2.14 细胞能动性分析 |
| 3.2.15 H_2O_2耐受和温度耐受分析 |
| 3.2.16 胞外多糖定量分析 |
| 3.2.17 生物被膜合成能力分析 |
| 3.2.18 L-蛋氨酸和L-高半胱氨酸对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素能力影响分析 |
| 3.2.19 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素能力分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素负调控因子MetR的功能验证 |
| 3.3.2 MetR抑制灵菌红素合成基因簇pig基因簇的转录水平 |
| 3.3.3 比较转录组学分析metR突变株ZK66 及野生型菌株JNB5-1 间基因表达差异 |
| 3.3.4 PigP、Hfq、SlyA、PstS和 RsmA参与调控粘质沙雷氏菌JNB5-1 合成灵菌红素 |
| 3.3.5 MetR通过抑制灵菌红素合成正调控因子PigP的转录水平间接调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素 |
| 3.3.6 MetR参与调控粘质沙雷氏菌合成L-蛋氨酸 |
| 3.3.7 L-蛋氨酸参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素 |
| 3.3.8 MetR参与调控粘质沙雷氏菌细胞能动性 |
| 3.3.9 MetR参与调控粘质沙雷氏菌H2O2 耐受性 |
| 3.3.10 MetR参与调控粘质沙雷氏菌温度耐受性 |
| 3.3.11 MetR参与调控粘质沙雷氏菌胞外多糖生物合成和生物被膜形成 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 转录调控因子RcsB参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及其功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 引物 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 培养基与培养条件 |
| 4.2.5 转座子插入突变文库的构建以及突变株SK68的筛选 |
| 4.2.6 突变株SK68中Tn5G转座子插入位点的鉴定 |
| 4.2.7 粘质沙雷氏菌基因缺失突变株的构建及过表达菌株的构建 |
| 4.2.8 生长曲线的测定 |
| 4.2.9 RNA的提取和RT-qPCR |
| 4.2.10 转录融合报告基因的构建 |
| 4.2.11 β-半乳糖苷酶酶活的测定 |
| 4.2.12 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 4.2.13 比较转录组学分析 |
| 4.2.14 细胞能动性分析 |
| 4.2.15 pH耐受分析 |
| 4.2.16 胞外多糖定量分析 |
| 4.2.17 生物被膜合成能力分析 |
| 4.2.18 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素能力分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素负调控因子RcsB的功能验证 |
| 4.3.2 RcsB抑制灵菌红素合成基因簇pig基因簇的转录水平 |
| 4.3.3 比较转录组学分析rcsB突变株SK68 及野生型菌株JNB5-1 间基因表达差异 |
| 4.3.4 RcsB通过抑制灵菌红素合成正调控因子FlhDC的转录水平间接调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素 |
| 4.3.5 RcsB作用于flhDC基因启动子区域结合位点的确定 |
| 4.3.6 RcsB参与调控粘质沙雷氏菌荚膜多糖生物合成 |
| 4.3.7 RcsB参与调控粘质沙雷氏菌细胞能动性 |
| 4.3.8 RcsB参与调控粘质沙雷氏菌耐酸性 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转录调控因子PsrA和 PsrB参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制解析及PsrA功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 引物 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 培养基与培养条件 |
| 5.2.5 转座子插入突变文库的构建以及突变株SK8-37和SK8-61的筛选 |
| 5.2.6 突变株SK8-37和SK8-61中Tn5G转座子插入位点的鉴定 |
| 5.2.7 粘质沙雷氏菌基因缺失突变株的构建及过表达菌株的构建 |
| 5.2.8 生长曲线的测定 |
| 5.2.9 RNA的提取和RT-qPCR |
| 5.2.10 转录融合报告基因的构建 |
| 5.2.11 β-半乳糖苷酶酶活的测定 |
| 5.2.12 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 5.2.13 比较转录组学分析 |
| 5.2.14 细胞能动性分析 |
| 5.2.15 胞外多糖定量分析 |
| 5.2.16 生物被膜合成能力分析 |
| 5.2.17 表面活性剂类物质serrawettin W1 合成能力分析 |
| 5.2.18 抗细菌竞争实验 |
| 5.2.19 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素能力分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素正调控因子PsrA的功能验证 |
| 5.3.2 粘质沙雷氏菌合成灵菌红素正调控因子PsrB的功能验证 |
| 5.3.3 PsrA参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制解析 |
| 5.3.4 PsrB参与调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制解析 |
| 5.3.5 LysR家族转录调控因子PsrA的生物多样性分析 |
| 5.3.6 比较转录组学分析菌株JNB5-1及SK8-37间基因表达差异 |
| 5.3.7 PsrA参与调控粘质沙雷氏菌细胞能动性 |
| 5.3.8 PsrA参与调控粘质沙雷氏菌胞外多糖合成、生物被膜形成和表面活性剂类物质serrawettin W1 生物合成 |
| 5.3.9 PsrA参与调控粘质沙雷氏菌T6SS介导的杀菌能力 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 代谢工程改造粘质沙雷氏菌高产灵菌红素 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 菌株与质粒 |
| 6.2.2 引物 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.2.4 培养基与培养条件 |
| 6.2.5 粘质沙雷氏菌产灵菌红素工程菌株的构建 |
| 6.2.6 比较转录组学分析 |
| 6.2.7 RNA的提取和RT-qPCR |
| 6.2.8 转录融合报告基因的构建 |
| 6.2.9 β-半乳糖苷酶酶活的测定 |
| 6.2.10 生长曲线的测定 |
| 6.2.11 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素能力分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 粘质沙雷氏菌单基因突变株发酵产灵菌红素分析 |
| 6.3.2 粘质沙雷氏菌整合突变株发酵产灵菌红素分析 |
| 6.3.3 发酵不同时期菌株JNB5-1表达差异基因分析与验证 |
| 6.3.4 粘质沙雷氏菌组成型强启动子PSMWW4_v1c02160 的发现与验证 |
| 6.3.5 粘质沙雷氏菌工程菌株SK68ΔMetR-PSMWW4_vlc02160-PsrA-PsrB发酵产灵菌红素分析 |
| 6.4 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:附表 |
| 附录Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文及申请的专利 |
（3）毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物耐盐研究进展 |
| 1.3 杨树的研究进展 |
| 1.3.1 杨树生物学特性 |
| 1.3.2 杨树生物与非生物胁迫研究进展 |
| 1.3.3 杨树耐盐机理的研究进展 |
| 1.4 固有无序蛋白质的研究进展 |
| 1.4.1 固有无序蛋白的分类及其特点 |
| 1.4.2 固有无序蛋白的功能 |
| 1.4.3 固有无序蛋白作用机理 |
| 1.5 PtrIDP1基因研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 毛果杨PtrIDP1基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基配制 |
| 2.1.5 引物合成与测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法提取毛果杨RNA |
| 2.2.2 毛果杨cDNA的合成 |
| 2.2.3 PtrIDP1基因的克隆 |
| 2.2.4 胶回收PCR产物 |
| 2.2.5 构建pROKⅡ-PtrIDP1过表达载体 |
| 2.2.6 pROKⅡ-PtrIDP1重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.7 阳性克隆PCR检测 |
| 2.2.8 PtrIDP1基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 毛果杨总RNA的提取 |
| 2.3.2 PtrIDP1基因克隆 |
| 2.3.3 PtrIDP1基因与pROKⅡ载体双酶切 |
| 2.3.4 pROKⅡ-PtrIDP1菌液PCR |
| 2.3.5 PtrIDP1基因生物信息学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 PtrIDP1基因表达特性分析及亚细胞定位 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 PtrIDP1基因的组织特异性表达检测 |
| 3.2.2 PtrIDP1基因在NaCl和PEG胁迫下的表达特性分析 |
| 3.2.3 毛果杨总RNA的提取及cDNA合成 |
| 3.2.4 PtrIDP1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PtrIDP1基因的组织表达特性 |
| 3.3.2 PtrIDP1基因在NaCl胁迫下的表达 |
| 3.3.3 PtrIDP1基因在PEG胁迫下的表达 |
| 3.3.4 PtrIDP1蛋白质亚细胞定位分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 PtrIDP1基因遗传转化毛果杨及其功能分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试验菌种 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配置 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 使用电击法转化农杆菌感受态细胞(EHA105) |
| 4.2.2 pROKⅡ-PtrIDP1重组农杆菌阳性克隆鉴定 |
| 4.2.3 扩大培养及菌种保存 |
| 4.2.4 根癌农杆菌介导的毛果杨遗传转化 |
| 4.2.5 转基因毛果杨的分子鉴定 |
| 4.3 PtrIDP1转基因毛果杨在盐胁迫下的抗逆性分析 |
| 4.3.1 转基因毛果杨在盐胁迫下的形态学分析 |
| 4.3.2 转基因毛果杨耐盐生理指标分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒农杆菌转化 |
| 4.4.2 转PtrIDP1基因毛果杨植株的获得 |
| 4.4.3 转PtrIDP1基因毛果杨PCR鉴定 |
| 4.4.4 转基因毛果杨在盐胁迫下的形态学分析 |
| 4.4.5 转基因毛果杨在NaCl胁迫下的生理指标分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）小麦基因编辑体系优化和几个内源基因的编辑及突变体创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因编辑技术的发展和应用 |
| 1.1.1 ZFN编辑技术及其应用 |
| 1.1.2 TALEN编辑技术及其应用 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9 编辑技术及其应用 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9 编辑系统在小麦中的应用 |
| 1.1.5 CRISPR/xCas9和CRISPR/Cpf1 编辑系统及其应用 |
| 1.2 基因编辑技术在作物单倍体诱导中的应用 |
| 1.3 穗发育相关基因的研究进展 |
| 1.4 籽粒淀粉合成酶相关基因的研究进展 |
| 1.5 氮代谢相关基因的研究进程 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 小麦农杆菌介导高效基因编辑体系建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体、酶及主要试剂 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 染色体原位杂交检测 |
| 2.2.2 CRISPR表达载体构建 |
| 2.2.3 表达载体转入农杆菌 |
| 2.2.4 农杆菌介导的小麦遗传转化 |
| 2.2.5 T_0代阳性转基因植株鉴定 |
| 2.2.6 转基因植株突变类型检测 |
| 2.2.7 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 无筛选标记转GUS基因材料染色体原位杂交鉴定 |
| 2.3.2 无筛选标记转GUS基因材料主要农艺性状鉴定 |
| 2.3.3 CRISPR/SpCas9 系统中不同启动子调控sgRNA编辑效率比较 |
| 2.3.4 CRISPR/SpCas9 系统中2 个串联sgRNA对目标基因的编辑效率比较 |
| 2.3.5 CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9 系统编辑效率比较 |
| 2.3.6 T_0代编辑植株中GUS基因序列分析 |
| 2.3.7 GUS基因编辑植株后代遗传稳定性分析 |
| 2.3.8 脱靶情况分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小麦TaMTL基因编辑和单倍体植株诱导 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 载体、酶及主要试剂 |
| 3.1.3 引物序列 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CRISPR表达载体构建 |
| 3.2.2 表达载体转入农杆菌 |
| 3.2.3 农杆菌介导的小麦遗传转化 |
| 3.2.4 T_0代阳性转基因植株鉴定 |
| 3.2.5 转基因植株突变类型检测 |
| 3.2.6 单倍体植株鉴定 |
| 3.2.7 脱靶检测 |
| 3.2.8 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用优化的CRISPR/SpCas9 系统对TaMTL基因进行编辑 |
| 3.3.2 TaMTL基因编辑植株表型鉴定 |
| 3.3.3 单倍体植株细胞学鉴定 |
| 3.3.4 单倍体诱导相关基因表达分析 |
| 3.3.5 脱靶情况分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小麦TaQ基因编辑和表型鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体、酶及主要试剂 |
| 4.1.3 引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 CRISPR表达载体构建 |
| 4.2.2 表达载体转入农杆菌 |
| 4.2.3 农杆菌介导的小麦遗传转化 |
| 4.2.4 转基因植株突变类型检测 |
| 4.2.5 甲苯胺蓝和番红固绿染色 |
| 4.2.6 脱靶检测 |
| 4.2.7 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 利用优化的CRISPR/SpCas9 系统对TaQ基因进行编辑 |
| 4.3.2 TaQ基因突变对T0代转基因植株穗型影响 |
| 4.3.3 T_1代编辑植株中TaQ基因不同突变类型的表型效应 |
| 4.3.4 TaQ基因不同突变类型中穗发育相关基因表达量分析 |
| 4.3.5 脱靶情况分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 小麦TaWaxy基因编辑和对籽粒淀粉合成的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体、酶及主要试剂 |
| 5.1.3 引物序列 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 CRISPR表达载体构建 |
| 5.2.2 表达载体转入农杆菌 |
| 5.2.3 农杆菌介导的小麦遗传转化 |
| 5.2.4 T_0代阳性转基因植株鉴定 |
| 5.2.5 转基因植株突变类型检测 |
| 5.2.6 籽粒I_2-KI染色 |
| 5.2.7 淀粉颗粒透射电镜观察 |
| 5.2.8 淀粉含量、直链淀粉含量、淀粉糊化温度和淀粉胶稠度测定 |
| 5.2.9 脱靶检测 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CRISPR/SpCas9 载体转化和TaWaxy基因编辑 |
| 5.3.2 TaWaxy基因在7AS、4AL和7DS染色体上编辑类型鉴定 |
| 5.3.3 TaWaxy基因编辑植株功能分析 |
| 5.3.4 TaWaxy基因编辑植株籽粒淀粉品质测定 |
| 5.3.5 脱靶情况分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 小麦TaARG基因编辑及其功能分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体、酶及主要试剂 |
| 6.1.3 引物序列 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 CRISPR表达载体构建 |
| 6.2.2 表达载体转入农杆菌 |
| 6.2.3 农杆菌介导的小麦遗传转化 |
| 6.2.4 T_0代阳性转基因植株鉴定 |
| 6.2.5 转基因植株突变类型检测 |
| 6.2.6 氨基酸和蛋白质含量测定 |
| 6.2.7 亚精胺含量测定 |
| 6.2.8 数据统计分析 |
| 6.2.9 脱靶检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 编辑小麦TaARG基因植株获得和检测情况 |
| 6.3.2 编辑株系中氮代谢相关基因表达量分析 |
| 6.3.3 TaARG基因编辑植株主要农艺性状分析 |
| 6.3.4 TaARG基因编辑植株中各种氨基酸、蛋白质和亚精胺含量测定 |
| 6.3.5 脱靶情况分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 优化了小麦农杆菌介导的高效CRISPR/SpCas9 编辑体系,利用CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9 系统也获得了小麦编辑植株 |
| 7.2 利用优化的CRISPR/SpCas9 编辑体系编辑小麦TaMTL基因,获得了单倍体籽粒,建立了小麦单倍体高效诱导体系 |
| 7.3 利用优化的CRISPR/SpCas9 编辑体系编辑小麦TaQ基因获得了预期表型,分析了TaQ基因调控小麦穗部结构的分子网络 |
| 7.4 利用优化的CRISPR/SpCas9 系统编辑小麦TaWaxy基因,显着降低了籽粒中直链淀粉含量,A型淀粉颗粒在结构上发生了明显改变 |
| 7.5 利用CRISPR/SpCas9 系统编辑小麦TaARG基因改变了不同组织和器官中的氨基酸、蛋白质和亚精胺的含量 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物启动子 |
| 1.2 植物启动子的基本结构 |
| 1.2.1 核心启动子 |
| 1.2.2 上游启动子区 |
| 1.3 启动子的类型 |
| 1.3.1 组成型启动子 |
| 1.3.2 诱导型启动子 |
| 1.3.3 组织特异性启动子 |
| 1.4 启动子的克隆方法 |
| 1.4.1 常规PCR技术 |
| 1.4.2 探针载体筛选启动子 |
| 1.4.3 基于PCR技术克隆启动子 |
| 1.4.4 基因组文库筛选启动子 |
| 1.5 启动子的研究方法 |
| 1.5.1 生物信息学分析与预测 |
| 1.5.2 瞬时表达分析 |
| 1.5.3 稳定表达分析 |
| 1.5.4 点突变 |
| 1.5.5 凝胶阻滞分析 |
| 1.6 RIQ基因的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 GmRIQ2基因启动子全长序列及缺失片段的克隆 |
| 2.2.2 GmRIQ2基因启动子全长序列分析 |
| 2.2.3 植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.4 发根农杆菌介导转化大豆子叶节 |
| 2.2.5 农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥 |
| 2.2.6 GUS组织染色和定量分析 |
| 2.2.7 转基因拟南芥的激素和逆境处理 |
| 2.2.8 大豆KF16植株的激素处理 |
| 2.2.9 大豆Gm RIQ2 基因的实时荧光定量PCR分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大豆GmRIQ2基因启动子的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1.1 大豆GmRIQ2基因启动子序列的获得 |
| 3.1.2 大豆GmRIQ2基因启动子的生物信息学分析 |
| 3.2 大豆GmRIQ2基因启动子植物表达载体构建及农杆菌转化 |
| 3.2.1 植物表达载体构建 |
| 3.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌及鉴定 |
| 3.3 pCAMBIA3301Gm RIQ2::GUS转化大豆子叶节及鉴定 |
| 3.3.1 转基因大豆子叶节的获得 |
| 3.3.2 转基因大豆根PCR检测 |
| 3.3.3 转基因大豆根GUS活性组织化学检测 |
| 3.3.4 转基因大豆根的诱导转化效率 |
| 3.4 pCAMBIA3301Gm RIQ2::GUS转化拟南芥及鉴定 |
| 3.4.1 转基因拟南芥的获得 |
| 3.4.2 转基因拟南芥PCR检测 |
| 3.4.3 转基因拟南芥GUS活性组织化学检测 |
| 3.5 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段的克隆及转化拟南芥的鉴定 |
| 3.5.1 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段的获得 |
| 3.5.2 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段植物表达载体构建 |
| 3.5.3 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段表达载体转化农杆菌 |
| 3.5.4 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段表达载体转化拟南芥 |
| 3.6 GmRIQ2基因全长及各缺失片段启动子的功能分析 |
| 3.6.1 激素处理的转基因拟南芥GUS酶活性检测 |
| 3.6.2 逆境处理的转基因拟南芥GUS酶活性检测 |
| 3.7 激素处理的GmRIQ2基因在大豆中的表达量分析 |
| 3.7.1 大豆RNA的提取 |
| 3.7.2 生长素(IAA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 3.7.3 脱落酸(ABA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 3.7.4 茉莉酸甲酯(Me JA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GUS基因在启动子活性分析中的应用 |
| 4.2 5'缺失法构建启动子缺失片段 |
| 4.3 GmRIQ2基因启动子的序列分析 |
| 4.4 GmRIQ2基因启动子的维管组织表达特异性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）S1DNMT2基因RNAi表达载体构建及其功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 DNA甲基化 |
| 1.1.1 植物DNA甲基化的概念 |
| 1.1.2 DNA甲基化作用的关键酶—DNA甲基转移酶 |
| 1.1.3 DNA甲基化应用及其前景 |
| 1.2 植物抗逆性研究 |
| 1.2.1 生物胁迫与非生物胁迫 |
| 1.2.2 植物抗逆性的研究进展与意义 |
| 1.3 转基因番茄的研究现状 |
| 1.4 RNA干扰技术在植物基因组学中的应用 |
| 1.4.1 RNA干扰技术的概念 |
| 1.4.2 RNA干扰技术要点及其应用 |
| 1.5 农杆菌介导法及其在基因工程中的应用 |
| 1.5.1 农杆菌介导的转化机理 |
| 1.5.2 农杆菌介导法影响因素 |
| 1.5.3 农杆菌介导法应用前景 |
| 1.6 植物组培及其在基因组学中的应用 |
| 1.6.1 植物组培的概念 |
| 1.6.2 植物组培的关键要素及其应用前景 |
| 1.7 植物蛋白亚细胞定位及其在基因工程中的应用 |
| 1.7.1 亚细胞定位的概念和机理 |
| 1.7.2 亚细胞定位的应用前景 |
| 1.8 本实验研究相关内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器设备 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.3 相关引物信息 |
| 2.2 实验中主要仪器设备 |
| 2.2.1 本实验中主要仪器 |
| 2.2.2 实验器皿 |
| 2.3 实验相关试剂 |
| 2.3.1 本实验中涉及的相关酶 |
| 2.3.2 本实验中涉及的相关化学试剂 |
| 2.4 本实验中常用的试剂耗材 |
| 2.5 相关试剂和培养基的配制 |
| 2.5.1 分子实验中相关培养基的配制 |
| 2.5.2 分子实验中相关试剂的配制 |
| 2.5.3 植物组织培养中常用试剂的配制 |
| 2.5.4 植物组织培养中相关植物激素的配制 |
| 2.5.5 植物组织培养中相关培养基的配制 |
| 2.5.6 瞬时表达系统相关试剂的配置 |
| 2.6 相关引物设计 |
| 2.6.1 引物设计原则 |
| 2.6.2 引物设计基本步骤 |
| 2.7 植株总RNA提取 |
| 2.8 反转录获得cDNA |
| 2.8.1 反转录反应体系 |
| 2.8.2 逆转录PCR扩增程序 |
| 2.9 SlDNMT2 扩增 |
| 2.9.1 SlDNMT2 PCR反应体系 |
| 2.9.2 SlDNMT2 PCR反应程序 |
| 2.10 番茄RNAi表达载体的构建 |
| 2.10.1 特异性片段siRNA1的克隆 |
| 2.10.1.5 实验步骤 |
| 2.10.2 si RNA1与p SK载体的酶切、连接 |
| 2.10.3 特异性片段siRNA1阳性鉴定 |
| 2.10.4 特异性片段siRNA2克隆 |
| 2.10.5 特异性片段siRNA2阳性鉴定 |
| 2.10.6 p SK-si RNA重组质粒鉴定 |
| 2.10.7 p SK-si RNA质粒快提检测 |
| 2.10.8 重组质粒的发夹结构的验证 |
| 2.10.9 重组质粒的切胶回收 |
| 2.10.10 SlDNMT2-si RNA与 p BI121 连接 |
| 2.11 SlDNMT2 亚细胞定位 |
| 2.11.1 融合表达载体构建 |
| 2.11.2 烟草瞬时表达 |
| 2.12 SlDNMT2 组织特异性表达分析 |
| 2.13 番茄植株的遗传转化 |
| 2.13.1 大肠杆菌DH5α的制备 |
| 2.13.2 制备农杆菌感受态(CaCl2法) |
| 2.13.3 PCR产物或酶切产物纯化 |
| 2.13.4 SlDNMT2 与中间载体连接 |
| 2.13.5 连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.13.6 菌落PCR鉴定 |
| 2.13.7 SlDNMT2 酶切鉴定 |
| 2.13.8 SlDNMT2 测序和序列分析 |
| 2.13.9 p BI121-SlDNMT2-si RNA转化农杆菌 |
| 2.13.10 农杆菌单克隆阳性鉴定 |
| 2.14 植物组织培养实验 |
| 2.14.1 发种子 |
| 2.14.2 预培养 |
| 2.14.3 农杆菌侵染与共培养 |
| 2.14.4 筛选培养 |
| 2.14.5 生根培养 |
| 2.15 炼苗与移栽 |
| 2.16 DNA水平的阳性鉴定 |
| 2.17 RNA水平的阳性鉴定 |
| 2.17.1 定量PCR组分 |
| 2.17.2 定量PCR反应程序 |
| 2.17.3 实验步骤 |
| 2.18 非生物胁迫下的表型分析 |
| 2.18.1 鲜重分析 |
| 2.18.2 植株高度分析 |
| 2.18.3 植株侧根数分析 |
| 2.18.4 气孔数分析 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 SlDNMT2 生物信息学分析 |
| 3.2 SlDNMT2 基因c DNA序列克隆 |
| 3.3 SlDNMT2 表达模式分析 |
| 3.4 SlDNMT2 亚细胞定位分析 |
| 3.5 SlDNMT2 特异性片段si RNA克隆 |
| 3.6 siRNA1特异性序列阳性鉴定 |
| 3.7 siRNA2特异性序列阳性鉴定 |
| 3.8 发夹结构的验证 |
| 3.9 SlDNMT2 RNAi表达载体正确性检测 |
| 3.10 预培养 |
| 3.11 共培养 |
| 3.12 K60筛选培养 |
| 3.13 K65筛选培养 |
| 3.14 K70筛选培养 |
| 3.15 生根培养 |
| 3.16 转基因植株DNA水平的阳性鉴定 |
| 3.17 转基因植株RNA水平的定量分析 |
| 3.18 盐胁迫条件下的表型分析 |
| 3.19 甘露醇胁迫条件下的表型分析 |
| 3.20 二价重金属离子胁迫时的表型分析 |
| 3.21 干旱环境下转基因植物的表型分析 |
| 3.22 转基因植物叶片中气孔情况的分析 |
| 3.23 番茄中Sl TINY1、Sl SAG1 基因半定量分析 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 展望与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（7）茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 芳香植物的应用现状 |
| 1.2.1 芳香植物概述 |
| 1.2.2 芳香植物在园林绿化中的应用 |
| 1.2.3 芳香植物香气成分的应用 |
| 1.2.4 芳香植物分子育种 |
| 1.3 茉莉酸类物质对植物影响的研究进展 |
| 1.3.1 茉莉酸类物质对植物次生代谢的影响 |
| 1.3.2 茉莉酸类物质对植物生长发育的影响 |
| 1.4 观赏植物基因转录组学研究进展 |
| 1.4.1 转录组概述 |
| 1.4.2 转录组研究方法 |
| 1.4.3 转录组技术在植物基因挖掘及结构优化中的应用 |
| 1.4.4 转录组技术在植物分子标记中的应用 |
| 1.4.5 转录组技术在植物代谢通路分析中的应用 |
| 1.4.6 转录组技术在植物遗传育种和进化中的应用 |
| 1.5 观赏植物萜类代谢分子调控研究进展 |
| 1.5.1 植物萜类代谢途径 |
| 1.5.2 植物萜类代谢途径上主要酶基因 |
| 1.5.3 调控植物萜类物质生物合成的转录因子 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 茉莉酸甲酯对神农香菊毛状体及其分泌物的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同浓度处理对叶片表皮毛密度的影响 |
| 2.2.2 不同时间处理对叶片表皮毛密度的影响 |
| 2.2.3 不同浓度处理对叶片表面分泌物的影响 |
| 2.2.4 不同时间处理对叶片表面分泌物的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 茉莉酸甲酯诱导下的神农香菊转录组测序及分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料处理 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 神农香菊总RNA的质量分析 |
| 3.2.2 神农香菊转录组测序和组装结果分析 |
| 3.2.3 神农香菊转录组基因功能注释 |
| 3.2.4 神农香菊转录组差异表达基因分析 |
| 3.2.5 响应MeJA的JA生物合成和信号转导途径差异表达基因 |
| 3.2.6 响应MeJA的萜类物质合成途径差异表达基因 |
| 3.2.7 响应MeJA的苯丙烷类代谢途径差异表达基因 |
| 3.2.8 响应MeJA的脂肪酸类代谢途径差异表达基因 |
| 3.2.9 响应MeJA的植物后修饰酶类差异表达基因 |
| 3.2.10 响应MeJA的转录因子差异表达基因 |
| 3.2.11 qRT-PCR结果验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 神农香菊萜类物质合成途径关键基因CiGPS和CiFPS的克隆及其功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂及菌株 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CiGPS和CiFPS基因ORF框的克隆 |
| 4.2.2 CiGPS和CiFPS基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 CiGPS和CiFPS基因的表达模式分析 |
| 4.2.4 神农香菊CiGPS和CiFPS基因表达载体构建 |
| 4.2.5 转CiGPS和CiFPS基因烟草的获得及分子鉴定 |
| 4.2.6 转基因烟草外部形态观察 |
| 4.2.7 转基因烟草叶绿素含量的分析 |
| 4.2.8 转基因烟草叶片表皮毛形态和密度的分析 |
| 4.2.9 转基因烟草叶片分泌物含量的分析 |
| 4.2.10 转基因烟草GPS和FPS酶活性的分析 |
| 4.2.11 转基因烟草萜类物质合成途径基因的表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 神农香菊CiMYC2转录因子的克隆及其功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试剂及菌株 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CiMYC2基因ORF框的克隆 |
| 5.2.2 CiMYC2基因的生物信息学分析 |
| 5.2.3 CiMYC2基因的表达模式分析 |
| 5.2.4 神农香菊CiMYC2基因表达载体构建 |
| 5.2.5 神农香菊CiMYC2基因亚细胞定位检测 |
| 5.2.6 转CiMYC2基因烟草的获得及分子鉴定 |
| 5.2.7 转基因烟草外部形态观察 |
| 5.2.8 转基因烟草叶绿素含量的分析 |
| 5.2.9 转基因烟草叶片表皮毛密度的分析 |
| 5.2.10 转基因烟草叶片分泌物含量的分析 |
| 5.2.11 转基因烟草萜类物质合成途径基因的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 橡胶树白粉菌 |
| 1.1.1 橡胶树及天然橡胶 |
| 1.1.2 橡胶树白粉病 |
| 1.1.3 橡胶树白粉菌(Oidium heveae Steinm) |
| 1.2 丝状真菌的遗传转化 |
| 1.2.1 基因工程的选择标记 |
| 1.2.2 丝状真菌的遗传转化方法 |
| 1.2.3 专性寄生真菌的遗传转化 |
| 1.2.4 橡胶树白粉菌的遗传转化 |
| 1.3 启动子 |
| 1.3.1 启动子的概念 |
| 1.3.2 真核生物的启动子 |
| 1.3.3 组成型启动子 |
| 1.3.4 诱导型启动子 |
| 1.3.5 丝状真菌的启动子 |
| 1.3.6 启动子的克隆方法 |
| 1.3.7 启动子的研究方法及策略 |
| 1.3.8 启动子研究中存在的问题和不足 |
| 1.4 hrp基因hpa Xm |
| 1.4.1 Harpin蛋白及hrp基因 |
| 1.4.2 hpa Xm基因及Hpa Xm蛋白 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 微生物材料 |
| 2.1.3 化学药品和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 1%琼脂糖平板上橡胶树白粉菌分生孢子萌发率的测定 |
| 2.2.2 抗生素的植物毒性(phytotoxicity)评估 |
| 2.2.3 确定合适的抗生素抗性基因用作筛选标记 |
| 2.2.4 重组载体的构建 |
| 2.2.5 适合橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液的确定 |
| 2.2.6 O.heveae的电击转化 |
| 2.2.7 O.heveae的 ATMT |
| 2.2.8 转化子的显微分析 |
| 2.2.9 转化子的分子分析 |
| 2.2.10 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 2.2.11 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 2.2.12 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因GUS瞬时表达量测定 |
| 2.2.13 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因表达范围的探索 |
| 2.2.14 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 2.2.15 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 2.2.16 橡胶树白粉菌内源强启动子序列全长分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 橡胶树白粉菌分生孢子萌发最佳测定时间的确定 |
| 3.2 橡胶树白粉菌分生孢子常用抗生素敏感性测定 |
| 3.3 抗生素的植物毒性评估 |
| 3.4 确定合适的筛选抗性基因 |
| 3.5 重组载体的构建 |
| 3.6 确定合适的电击缓冲液 |
| 3.7 橡胶树白粉菌电击转化 |
| 3.8 ATMT法转化橡胶树白粉菌 |
| 3.9 转化子的荧光观察 |
| 3.10 转化子的分子分析 |
| 3.10.1 T3代转化子的PCR验证 |
| 3.10.2 Southern blot analysis |
| 3.11 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 3.12 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 3.12.1 橡胶树白粉菌内源启动子克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.12.2 三亲杂交 |
| 3.12.3 橡胶树白粉菌内源疑似启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达 |
| 3.13 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因GUS瞬时表达效率测定 |
| 3.14 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的范围探索 |
| 3.14.1 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在双子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.14.2 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在单子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.15 橡胶树白粉菌内源强启动子的类型分析 |
| 3.15.1 转基因烟草的组培 |
| 3.15.2 T1代转基因烟草的分子检测 |
| 3.15.3 橡胶树白粉菌内源启动子的类型及序列分析 |
| 3.16 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 3.16.1 植物表达载体构建 |
| 3.16.2 WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的稳定表达 |
| 3.16.3 稳定表达及分子检测 |
| 3.16.4 WY195-hpa Xm转基因烟草T1 代的TMV检测 |
| 3.17 橡胶树白粉菌内源强启动子WY195序列全长分析 |
| 3.17.1 橡胶树白粉菌内源启动子WY195序列的生物信息学分析 |
| 3.17.2 渐变缺失分析WY195启动子的有效全长 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建 |
| 4.1.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系开发中的关键创新 |
| 4.1.2 其它技术限制 |
| 4.1.3 总结与展望 |
| 4.2 橡胶树白粉菌内源启动子的预测及功能鉴定 |
| 4.2.1 丝状真菌的内源启动子具有很大的开发潜力 |
| 4.2.2 橡胶树白粉菌内源强启动子具有很强的驱动外源基因表达能力 |
| 4.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子具有广泛的调控表达谱 |
| 4.2.4 后续工作及展望 |
| 5 结论 |
| 5.1 橡胶树白粉菌遗传转化的建立 |
| 5.1.1 橡胶树白粉菌抗生素敏感性评价 |
| 5.1.2 橡胶树白粉菌电击缓冲液的确定 |
| 5.1.3 橡胶树白粉菌的电击转化 |
| 5.1.4 橡胶树白粉菌的ATMT转化 |
| 5.2 橡胶树白粉菌内源启动子资源初探 |
| 5.2.1 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 5.2.2 橡胶树白粉菌内源疑似启动子的功能验证 |
| 5.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的能力测定 |
| 5.2.4 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因转录范围研究 |
| 5.2.5 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 5.2.6 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 调控外源基因hpa Xm在烟草中的表达 |
| 5.2.7 橡胶树白粉菌内源启动子WY195的全长分析 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物雄性不育 |
| 1.2 Barnase及Barstar在植物基因工程中的应用 |
| 1.3 启动子 |
| 1.4 拟南芥花的发育进程 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 AtDADI启动子在拟南芥中的功能分析 |
| 3.1 AtDAD1启动子的背景 |
| 3.2 DADB及其5’和3’端删除表达载体对农杆菌菌株GV3101的转化 |
| 3.3 转pRDADX拟南芥的获得及PCR检测 |
| 3.4 转pRDADX拟南芥的GUS染色结果 |
| 第四章 在拟南芥中构建诱导恢复性雄性不育体系初探 |
| 4.1 诱导恢复性雄性不育表达载体的构建及转化拟南芥 |
| 4.2 诱导恢复性雄性不育拟南芥T_1代的PCR检测 |
| 4.3 诱导恢复性雄性不育拟南芥T_1代表型观察 |
| 第五章 在拟南芥中构建诱导恢复性智能雄性不育体系 |
| 5.1 基于花丝特异性启动子的新型雄性不育的构建与转基因雄性不育拟南芥的获得 |
| 5.2 诱导恢复性智能雄性不育(IMS)的构建与转IMS拟南芥的获得 |
| 第六章 IMS系统在甘蓝型油菜中的验证 |
| 6.1 转诱导恢复性智能雄性不育(IMS)甘蓝型油菜植株的获得 |
| 6.2 转IMS油菜植株的表型观察与育性鉴定 |
| 第七章 分析和讨论 |
| 7.1 花丝特异性启动子DADB的生物信息学分析 |
| 7.2 DADB及其删除序列在烟草和拟南芥中的GUS表达对比分析 |
| 7.3 DADB驱动mBarnV基因表达导致雄性不育表型的原因讨论 |
| 7.4 诱导恢复性智能雄性不育甘蓝型油菜表型不明显原因讨论 |
| 7.5 诱导恢复性智能雄性不育体系的优势讨论 |
| 第八章 结论和展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 甜菜素合成的亚细胞腔室及过氧化氢-酚氧化酶的亚细胞定位 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 甜菜素合成关键酶的亚细胞定位 |
| 1.4 红苋菜过氧化氢-酚氧化酶AcCATPO的亚细胞定位 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 1.7 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 粘细菌简介 |
| 1.1 粘细菌的基本特征 |
| 1.2 粘细菌的分布及分类 |
| 1.3 粘细菌对大分子化合物的利用 |
| 2 麦芽糖淀粉酶的研究进展 |
| 2.1 麦芽糖淀粉酶的分类与基本性质 |
| 2.2 不同微生物来源的麦芽糖淀粉酶 |
| 2.3 麦芽糖淀粉酶催化机制的研究进展 |
| 2.4 麦芽糖淀粉酶的应用 |
| 3 β-葡聚糖酶的研究进展 |
| 3.1 β-葡聚糖简介 |
| 3.2 β-葡聚糖酶的分类 |
| 3.3 β-1,3-葡聚糖酶研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 Corallococcus sp. EGB来源的麦芽糖淀粉酶基因的克隆及其催化特性的研究 |
| 第一节 Corallococcus sp. EGB麦芽糖淀粉酶基因的克隆及酶学性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 供试菌株的培养 |
| 1.4 淀粉酶的酶活力测定 |
| 1.5 蛋白含量的测定 |
| 1.6 菌体总DNA提取 |
| 1.7 大肠杆菌普通感受态细胞的制备 |
| 1.8 转化感受细胞 |
| 1.9 质粒的提取 |
| 1.10 麦芽糖淀粉酶基因coMA的重组表达菌株的构建 |
| 1.11 重组麦芽糖淀粉酶CoMA的诱导表达与纯化 |
| 1.12 重组酶CoMA的酶学特性 |
| 1.13 序列分析软件、在线分析网址 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 麦芽糖淀粉酶基因的克隆 |
| 2.2 CoMA蛋白序列分析 |
| 2.3 麦芽糖淀粉酶CoMA的蛋白结构模拟 |
| 2.4 重组麦芽糖淀粉酶CoMA的表达纯化及酶谱分析 |
| 2.5 重组酶CoMA的酶学特性研究 |
| 3 讨论 |
| 第二节 麦芽糖淀粉酶CoMA催化特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 阿卡波糖对重组酶CoMA活性的抑制作用 |
| 1.3 重组酶CoMA对淀粉的水解方式 |
| 1.4 重组酶CoMA对可溶性淀粉的水解特性研究 |
| 1.5 重组酶CoMA对麦芽三糖的水解特性研究 |
| 1.6 重组酶CoMA的化学修饰及定点突变 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阿卡波糖对重组酶CoMA活性的抑制作用 |
| 2.2 重组酶CoMA对淀粉的水解方式 |
| 2.3 重组酶CoMA对可溶性淀粉的水解特性研究 |
| 2.4 重组酶CoMA对麦芽三糖的水解特性研究 |
| 2.5 重组酶CoMA的多分子催化途径 |
| 2.6 重组酶CoMA的化学修饰及定点突变 |
| 2.7 CoMA在整个GH13家族中的系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 麦芽糖淀粉酶CoMA的高效表达及制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 第一节 麦芽糖淀粉酶CoMA在毕赤酵母中的表达及联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 表达菌株P.pastoris GS115(pEFαA-coMA/coMA_(27))的构建 |
| 1.4 表达菌株的诱导表达 |
| 1.5 酵母表达菌株胞外重组酶的纯化 |
| 1.6 CoMA联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因的PCR |
| 2.2 表达载体的构建和线性化 |
| 2.3 酵母阳性转化子的鉴定 |
| 2.4 重组酶CoMA_(27)的纯化及酶谱分析 |
| 2.5 CoMA联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖 |
| 3 讨论 |
| 第二节 液化型淀粉酶AmyM和麦芽糖淀粉酶CoMA融合蛋白的构建及其酶学性质的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 重叠延伸PCR构建融合蛋白 |
| 1.3 融合蛋白表达菌株的构建 |
| 1.4 融合蛋白表达菌株的诱导表达及纯化 |
| 1.5 淀粉酶的酶活性测定和蛋白含量的测定 |
| 1.6 不同连接肽连接的融合蛋白酶学性质的比较 |
| 1.7 同添加量的融合蛋白M-S2-C对麦芽糖得率的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重叠延伸PCR构建融合蛋白 |
| 2.2 不同连接肽对融合蛋白表达的影响 |
| 2.3 温度、pH对不同连接肽连接的融合蛋白的影响 |
| 2.4 不同连接肽对麦芽糖得率的影响 |
| 2.5 融合蛋白M-S2-C不同添加量对麦芽糖得率的影响 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 Corallococcus sp. EGB来源的β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其功能分析 |
| 第一节 Corallococcus sp. EGBβ-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其结构域功能的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基、试剂和仪器 |
| 1.3 酶活力测定和蛋白含量的测定 |
| 1.4 β-1,3-葡聚糖酶LamC全长基因的PCR扩增 |
| 1.5 β-1,3-葡聚糖酶基因序列分析 |
| 1.6 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物表达菌株的构建 |
| 1.7 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物重组酶的诱导表达与纯化 |
| 1.8 β-1,3-葡聚糖酶催化和非催化结构域的功能研究 |
| 1.9 β-1,3-葡聚糖酶活性中心定点突变 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆 |
| 2.2 β-1,3-葡聚糖酶LamC蛋白序列分析 |
| 2.3 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物的表达纯化 |
| 2.4 β-1,3-葡聚糖酶催化和非催化结构域的功能研究 |
| 3 讨论 |
| 第二节 β-1,3-葡聚糖酶LamC在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 β-1,3-葡聚糖酶LamC在毕赤酵母中的重组表达 |
| 1.4 重组酶LamC_(27)酶学性质的研究 |
| 1.5 重组酶LamC_(27)对稻瘟病菌生防作用的初步研究 |
| 2 结论与分析 |
| 2.1 重组酶LamC_(27)的表达与纯化 |
| 2.2 重组酶LamC_(27)的酶学性质研究 |
| 2.3 重组酶LamC_(27)对稻瘟病菌生防作用的初步研究 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
四、基因工程中常用的酶及其功能分析（论文参考文献）
- [1]大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析[D]. 李静. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [2]粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子的挖掘及其功能分析[D]. 潘学玮. 江南大学, 2020(04)
- [3]毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析[D]. 董实伟. 东北林业大学, 2020(08)
- [4]小麦基因编辑体系优化和几个内源基因的编辑及突变体创制[D]. 刘会云. 中国农业科学院, 2020
- [5]大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析[D]. 邓晶. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]S1DNMT2基因RNAi表达载体构建及其功能分析[D]. 张玉. 合肥工业大学, 2020(02)
- [7]茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析[D]. 高文杰. 东北林业大学, 2019(01)
- [8]橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究[D]. 王义. 海南大学, 2019(06)
- [9]诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用[D]. 陈宁. 中国农业大学, 2018(07)
- [10]粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析[D]. 周杰. 南京农业大学, 2017(07)